Сочетанное действие КФС №1 и №2 с пятым элементом на бактерицидные функции клеток врожденного иммунитета
Радькова Л. И., врач-терапевт, физиотерапевт, психолог, преподаватель высшей категории ВГГТК
В 1955 году немецкий врач Г. Г. Рекевег сформулировал теорию зашлакованности организма человека. Суть ее состоит в том, что заболевание – это проявление реакции организма на воздействие различных токсинов. Рекевег указал на наличие шести степеней зашлакованности организма, из которых первые три стадии определяются как тканевые (обратимые), а последующие – как клеточные (трудно- или необратимые). При оказании организму помощи различными способами на первых трех этапах он вновь возвращается в нормальный физиологичный режим гомеостаза. При переходе в следующие стадии токсины, накопленные в тканях органов, проникают внутрь клеток с ее последующим разрушением, что, в общем, выражается в нарушении функций. Проявляются болезни застоя типа кисты, фибромы, папилломы, аденомы, тромбофлебиты, опухоли и т.д, а также жировые отложения, заболевания, связанные с деформацией соединительных тканей органов. Это проявляется в виде патологических процессов: ревматизм, полиартрит, при которых мочевая кислота, являющаяся продуктом плохого усвоения белка организмом, накапливается в суставах и мышцах. При конечной стадии зашлакованности организма развиваются необратимые болезни, связанные с дегрануляцией клеток и органов, когда противораковая защита, обеспечиваемая ферментативной способностью толстого кишечника, равна нулю и патологические клетки формируются и растут беспрепятственно. Токсины в организме накапливаются не только в результате нарушения обмена веществ и функционирования ферментных систем, но и в результате жизнедеятельности различного рода патогенных микро- (вирусы и бактерии) и макроорганизмов (кишечные паразиты и т.п.).
На КФС №1 прописана поляризация наборов растений, обладающих антимикробным и антипаразитарным действием. Помимо того, что Корректор целенаправленно воздействует на процесс размножения патогенов, его действие способствует нормализации микрофлоры кишечника, повышая эффективность иммунной системы организма.
КФС №2 способствует выведению токсинов из организма путем регуляции обмена веществ, особенно органов мочевыводящей системы, и обладает иммуннокорригирующим эффектом. Информационная программа, записанная на КФС №2, содержит образы трав и минеральных агентов, усиливающих выделительные функции организма, способности клеток связывать токсины, а также активирующих защитные функции организма.
Сочетанное применение КФС №1 и №2 позволяет обезвредить и разрушить патогены, усилить и включить резервные механизмы освобождения организма от накопленных в процессе жизнедеятельности как патогенов, так и деградированных клеток самого организма.
Эффективную и быструю защиту организма от многочисленных патогенных факторов обеспечивает врожденный иммунитет – комплекс взаимосвязанных механизмов неспецифической резистентности системы иммунобиологического надзора. К основной системе защиты организма, которая способна идентифицировать и уничтожать патогены, принадлежит иммунная система. Существуют две формы иммунного ответа организма: приобретённая и врождённая. В систему врожденного иммунитета в первую очередь входят клеточные элементы – фагоциты (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, тканевые или тучные клетки) и киллерные клетки. Нейтрофилы являются короткоживущими, но чрезвычайно многочисленными, и им отведена триггерная роль в разрушении внеклеточных патогенов и их токсинов и инициации процесса воспаления. Эти клетки – основные участники острой фазы воспаления. Тогда как другая группа клеток, производных от моноцитов – макрофаги, относится к длительно живущим клеткам. Помимо того, что они являются профессиональными фагоцитами, это антигенпредставляющие клетки, маркирующие переход острой фазы воспаления в хроническую.
В связи с вышеизложенным, целью нашего исследования было изучение воздействия КФС с 5-м элементом №1 (с прописанным каналом космической Теургии «МАЙЯ» ЧАЙАН) и №2 (с прописанным каналом космической Теургии «МАЙЯ» БУЛ) на клетки врожденного иммунитета и бактерии Salmonella enteritidis.
Материалы и методы
Использовали КФС №1, который обеспечивает постепенное угнетение и гибель в организме человека патогенов, и КФС №2 с детоксикационной информационной программой, а также эти Корректоры с 5-м элементом, которые дополнены каналами Космической Теургии «МАЙЯ» ЧАЙАН и БУЛ с целенаправленным эффектом выведения токсических веществ из организма.
Контакт c КФС проводился отдельно c микроорганизмами Salmonella enteritidis, после воздействия 30 и 60 мин их жизнеспособность определялась специфическим красителем – акридиновым оранжевым. Флуорохромирование препаратов по способу Берталанффи с помощью указанного красителя позволяет проводить как морфологическое, так и цитохимическое исследование бактерий. Для оценки морфологии бактерий производили флуоресцентное микроскопирование препаратов при условиях флуоресценции: длина волны возбуждения – 430 нм, отсекающий фильтр – 515 нм.
В качестве модели использовали первичную культуру нейтрофилов и моноцитов/макрофагов из крови. Фракцию адгезирующих клеток получали из гепаринизированной (10 ед/мл) венозной периферической крови. В камере Горяева подсчитывали количество клеток с верификацией нейтрофилов и мононуклеаров по форме клеточного ядра. Число моноцитов составляло от 1 до 5% и нейтрофилов – от 47 до 72% от общего количества ядросодержащих клеток. Концентрацию клеток доводили до 2×106 кл/мл, клеточную суспензию разносили в пробирки Эпиндорфа. Лейкоцитарную суспензию вносили в лунки плоскодонного планшета для иммунологических реакций по 100 мкл в лунку, в триплетах для каждого образца. Время воздействия КФС составило 30 мин, после чего вносили суспензию бактерий из расчета 1 фагоцит на 10 микробных клеток. В качестве контроля служили клетки без воздействия КФС. После воздействия клетки высушивали на воздухе, фиксировали в парах формалина в течение 15 мин.
Определение активности АТФазы и 5`-нуклеотидазы. После контакта клеток с образцами в течение 0.5, 1, 2, 3, 4, 7, 12 и 18 часов отбирали адгезированные клетки, переносили в лунки иммунологического планшета, добавляли по 20 мкл субстрата для АТФазы, содержащего 8 мг АТP («Sigma-Aldrich», США) на 1 мл трис-HCl-буфера рН 7.8, включавшего 87 мг NaCl, 28,7 мг KCl, 52 мг MgCl2 6 H2O и отдельно по 20 мкл субстрата для 5`-нуклеотидазы, содержащего 4 мг АМФ («Sigma-Aldrich», США) на 1 мл указанного выше буфера, включающего 87 мг NaCl и 70 мг MgCl2, оставляли на 30 и 60 мин соответственно. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл смеси аскорбиновой и молибденовой кислот в соотношении 1:1. Через 20 мин оптическая плотность субстратов измерялась на вышеуказанном анализаторе при длине волны 620 нм.
Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) проводили методом Лойда в собственной модификации. В лунки планшетов с адгезированными клетками добавляли по 100 мкл субстрата для определения ЛДГ субстрат, содержащий 2 мг/мл йоднитротетразолия («Sigma-Aldrich», США) на основе указанного выше буфера и инкубировали при 37 °С в течение 30 мин. Клетки с включенными гранулами диформазана разрушали путем внесения 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0.04 М HCl, в течение 20 мин. Оптическая плотность субстратов измерялась на иммунологическом анализаторе при длине волны 650 нм.
Определение активности цитохромоксидазы (ЦХО) проводили по методу A. B. Novikoff (Novikoff A. B., Goldfischer S., 1969) в собственной модификации. К фиксированному монослою фагоцитов добавляли 100 мкл 0,1 М ацетатного буфера (рН 5,5), содержащего 10 мг/мл MnCl2, 0,33% перекиси водорода и 2 мг/мл диаминобензидина (ICN). После инкубирования в течение 10 мин при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл на лунку. Количество образующегося продукта определяли по поглощению на спектрофотометре при 492 нм. В качестве контроля использовались образцы с растворами субстратов и 10% серной кислоты.
Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов выражали в виде унифицированного показателя – индекса стимуляции (Т), в процентах, который вычисляли по формуле: Т = (No–Nk)/Nk х 100; где Nk – средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в нестимулированных клетках; No – средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в стимулированных клетках.
Результаты и обсуждение
Согласно использованному методу выявления жизнеспособности бактерий, окрашенных акридиновым оранжевым, микроорганизмы, содержащие неразрушенные ДНК, окрашиваются в зеленый цвет. Специфичность цитохимической окраски этим красителем на ДНК определяется воздействием на нуклеиновые кислоты специфического фермента – дезоксирибонуклеазы. Под его влиянием ДНК бактерий расщепляется, зеленое свечение исчезает и появляется желтое, сигнализирующее о наличии разрушенной ДНК в бактерии.
При изучении бактерицидных свойств Корректоров обнаружено, что КФС №1 и №2 обладают цитостатическим действием на S. еnteritidis, особенно КФС с 5-м элементом, которые дополнены каналами Космической Теургии «МАЙЯ» ЧАЙАН и БУЛ (рис. 1).
Рис. 1. Действие КФС с 5-м элементом: №1 (а, б) (дополнены каналом Космической Теургии «МАЙЯ» ЧАЙАН) и КФС №2 (в, г) (дополнены каналом Космической Теургии «МАЙЯ» БУЛ) на бактерии S. еnteritidis в течение 30 (а, в) и 60 (б, г) минут. Флуоресцентная микроскопия, окраска акридиновым оранжевым, увеличение Х 800.
Наиболее сильный эффект выявлялся при воздействии КФС №2 в течение 60 мин. Причем не только увеличивалось количество бактерий с разрушенной ДНК, но и изменялась их морфология. Палочковидные микроорганизмы (рис. 1а) под влиянием КФС №2 преобразовывались в кокковидные (рис. 1в, 1г), что указывало на их переход от состояния активного размножения в L-сферическое – период покоя.
При изучении ферментативной активности клеток в отношении бактерий, предварительно до внесения к фагоцитам подвергнутых воздействию КФС в течение 30 и 60 мин, обнаружено достоверное (р<0.05) различие показателей стимуляции. В случае контакта с S. еnteritidis, подвергнутых воздействию КФС №2, выявлялась повышенная активность эктоферментов мембраны клеток – 5`-нуклеотидазы и АТФ-азы (рис. 2а, 2б), а также фермента кислород-зависимой системы – лактадегидрогеназы. Тогда как в отношении показателей внутриклеточного содержания цитохромоксидазы, напротив, обнаруживалось снижение, что указывало на меньшее цитотоксическое воздействие бактерий, обработанных КФС №2, по сравнению с S. еnteritidis после воздействия КФС №1. Показатели ферментативной активности клеток, зараженных бактериями с различным временем воздействия КФС (р<0.05), достоверно не отличались.
Контроль – клетки без воздействия бактерий и КФС принят за 0%.
1. Клетки, зараженные S. Еnteritidis, после воздействия КФС №1 в течение 30 и 60 мин (1, 2);
2. Клетки, зараженные S. Еnteritidis, после воздействия КФС №2 в течение 30 и 60 мин (3, 4).
Определено, что КФС №1 стимулировал ферментативную активность клеток врожденного иммунитета (рис. 3). Так, обнаружено, что активность эктоферментов мембраны клеток – 5`-нуклеотидазы и АТФ-азы, которая позволяет оценить степень стимуляции этих клеток, возрастала под воздействием КФС №1 уже через 30 мин (рис. 3а, 3б). Подобная зависимость наблюдалась при изучении активности фермента бактерицидной кислородзависимой системы лактатдегидрогеназы (рис. 3в, 3г), более выраженная после 2-х часового контакта с бактериями. Причем в одинаковой степени стимулировалась активность ферментов клеток как при действии КФС, так и бактерий. 
Контроль – клетки без воздействия бактерий и КФС принят за 0%.
1. Зараженные S. еnteritidis клетки без воздействия КФС №1;
2. Клетки после воздействия КФС №1;
3. Зараженные S. еnteritidis клетки после 30 мин воздействия на них КФС №1; 4. Зараженные S. еnteritidis клетки после 60 мин воздействия на них КФС №1.
Интерес представляют данные, полученные при изучении внутриклеточного содержания цитохромоксидазы. При совместной инкубации фагоцитов S. еnteritidis в течение 120 мин отмечалось резкое возрастание показателей, что указывало на выраженное цитоксическое действие бактерий. В отношении ферментов, которые характеризуют бактериостатические свойства фагоцитов, зараженных S. еnteritidis, то после воздействия КФС №1 их активность в большей степени возрастала по сравнению с клетками, на которые не воздействовали КФС №1. Причем через 120 мин, напротив, отмечалось снижение показателей, что указывало на реализацию киллерного потенциала фагоцитов в отношении бактерий (рис. 3).
При изучении воздействия КФС №2 обнаружена стимуляция фагоцитов, на что указывали более высокие показатели активности ферментов, по сравнению с клетками, зараженными S. еnteritidis (рис. 4). Под влиянием КФС №2 достоверно (р<0.01) усиливалась активация нейтрофилов и макрофагов в ответ на инфицирование S. еnteritidis, а цитотоксическое действие бактерий нивелировалось, на что указывало снижение показателей активности цитохромоксидазы (рис. 4г). Известно, что этот фермент принимает участие в реакциях, сопровождающих гибель клеток путем некроза. Необходимо отметить, что при изучении активности фермента кислородобразующей бактерицидной системы в зараженных бактериями фагоцитах, наиболее высокие показатели обнаруживались при 30-минутном воздействии КФС №2 (рис. 4в). 
Контроль – клетки без воздействия бактерий и КФС принят за 0%.
1. Зараженные S. еnteritidis клетки без воздействия КФС №2;
2. Клетки после воздействия КФС №2;
3. Зараженные S. еnteritidis клетки после 30 мин воздействия на них КФС №2; 4. Зараженные S. еnteritidis клетки после 60 мин воздействия на них КФС №2.
Таким образом, наши данные продемонстрировали выраженное бактерицидное действие на сальмонеллы, причем КФС №2 с 5-м элементом (дополнен каналом Космической Теургии «МАЙЯ» БУЛ) обладает более высоким цитотоксическим эффектом по сравнению с КФС №1.
Увеличивалось количество бактерий с разрушенной ДНК, о чем свидетельствовало их свечение в испускающем канале, соответствующем длине волн желтого диапазона. Это указывало на конформационные изменения ДНК бактерий, которые происходят при активации ферментов, преобразующих двунитевые вторичные структуры в однонитевые. Известно, что под действием ультрафиолетового излучения акридиновый оранжевый окрашивает РНК и однонитевую ДНК в оранжевый цвет, двунитевую ДНК – в зеленый. Изменялась также и морфология бактерий, палочковидные микроорганизмы под влиянием КФС №2 преобразовывались в кокковидные, что указывало на их переход от состояния активного размножения в L-сферическое – период покоя.
Помимо вышеуказанного, комплексное исследование ферментативной активности клеток врожденного иммунитета показало выраженное стимулирующее воздействие на них КФС. Также, в случае заражения этих клеток бактериями, обнаружен усиливающий бактерицидную активность фагоцитов эффект КФС. Это может стать решающим фактором, определяющим перспективность сочетанного применения КФС в качестве иммуномодулирующего средства для повышения естественной резистентности организма к возбудителям инфекционных кишечных заболеваний. Повышение активности клеток врожденного иммунитета в качестве профессиональных фагоцитов усиливает их функции для уничтожения не только патогенов, но и различных деградированных остатков собственных клеток организма, что позволяет воздействовать с помощью КФС №1 и №2 с 5-м элементом на клиренс организма от токсинов.