ban 7

Интересное на сайте:

Бактерицидная эффективность Корректора Функционального Состояния

Плехова Наталья Геннадьевна

Плехова Наталья Геннадьевна
Член-кор. РАЕ, доктор биологических наук
Сомова Л.М.профессор, д.м.н.

  На настоящее время на долю кандидоза приходится подавляющее большинство случаев грибковых поражений слизистых оболочек. Возбудители глубоких микозов грибы рода Candida, который включает около 20 видов, наиболее из них изученным является Candida albicans, вызывают оппортунистические инфекции, поражая только иммунокомпрометированный макроорганизм. В 1999 г. кандидемия признана самостоятельной нозологической формой инфекции, и её значение привлекло внимание специалистов в странах Европейского континента и среди других госпитальных инфекционных заболеваний он занял, например в США, четвёртое место [7]. Из всех случаев кандидозов примерно половина приходится на отделения интенсивной терапии хирургических больных [5]. При этом передача патогенов может происходить от пациента к пациенту и от медицинского персонала к пациенту. Урогенитальный кандидоз (Genital yeast infection candidosis) - заболевание мочеполовой системы, вызванное дрожжеподобными грибами рода Candida. Приблизительно у 75 % женщин в течение жизни отмечается по крайней мере один эпизод вагинального кандидоза, а у 40-45 % из них отмечаются два и более рецидивов заболевания. При вагинальном кандидозе как эндогенной инфекции его этиология может отражать особенности кандидной колонизации полости рта и кишечника или кожи, а та, в свою очередь, - особенности диеты и бытовых условий.
  Называется четыре группы факторов [1], акцентированных на инвазивных и диссеминированных микотических инфекциях: использование широкоспектральных противобактериальных антибиотиков в течение 7 или более дней или назначение трёх и более названных антибиотиков, сахарный диабет, применение стероидных гормонов, острая почечная недостаточность, рак и другие опухоли, обширные ожоги второй и третьей степени, множественные травмы внутренних органов, тяжелые повреждения головы, внутрисосудистые катетеры, перитонеальный диализ, нейтропения в крови, возраст пациента за 40 лет и старше.
  Из приведенных данных следует: во-первых, кандидемии могут быть отнесены к разряду септических инфекционных заболеваний; во-вторых, кандидемия - лучший маркер гематогенного кандидоза; в-третьих, диссеминированный кандидоз относят к Candida инфекции, возникающей во многих, не соприкасающихся друг с другом органах и при которой предполагают гематогенное распространение патогена; различают острый диссеминированный кандидоз и хронический диссеминированный (гепато-спленический) кандидоз; в-четвёртых, названные выше факторы риска играют особую роль для возникновения кандидемий, поскольку Candida species  у большой массы людей входит в состав нормобиоты без проявления свойств патогенности.
  Понижение естественных защитных механизмов макроорганизма сопровождается возрастанием скорости размножения и роста С. albicans. Среди множества состояний, предрасполагающих к кандидозу, расстройствам иммунной системы уделяют наибольшее внимание. В последние годы популярным среди микологов стало мнение о том, что расстройства клеточного иммунитета, в том числе наблюдаемые при ВИЧ-инфекции и СПИД, предрасполагают почти исключительно к поверхностным формам кандидоза, а поражения внутренних органов невозможны без тяжелого расстройства фагоцитоза [2]. Защита макроорганизма от кандидной инфекции основывается на естественных факторах, которые присутствуют постоянно вне зависимости от инфекции и возбудителя и в большей степени неспецифических и специфических факторах иммунитета, которые направлены на элиминацию возбудителя и вырабатываются в ответ на его появление.
  Макрофаги и нейтрофилы выполняют основную работу по избавлению макроорганизма от Candida spp. Причем эти клетки осуществляют антигенпрезентирующую функцию для запуска факторов адаптивного иммунитета. Непосредственное распознавание осуществляется в основном за счет маннозосвязывающего рецептора, расположенного на макрофагах [9, 14]. Опосредованное опсонинами связывание обеспечивается рецепторами к Рс-фрагментам антител и рецепторам комплемента СК1 (многие виды Candida) и СRЗ (у С. albicans, см. ниже). Экспрессия и тех, и других рецепторов повышается под действием IL-15 и IL-4 [13] и снижается при выбросе активных веществ фагоцитами. Снижение экспрессии маннозосвязывающего рецептора и за счет этого - фагоцитоза под действием IFN 41 может обеспечивать защитный эффект, предотвращая поглощение гриба и разрушение тех клеток, которые не способны к завершенному фагоцитозу (например, клетки эндотелия) [6, 8].
  Первоначальным и главным предназначением Корректора № 1 является борьба с инфекционными агентами. Под воздействием КФС №1 их жизнедеятельность угнетается, инфекционные агенты гибнут, либо покидают человеческий организм. Активным началом в корректорах функционального состояния выступают информационные блоки и поляризация лечебных трав, записанных на магнитные носители КФС, а также образцы водных кристаллов Массару Эмото и др.
  Целью настоящего исследования явилось изучение механизма бактерицидного воздействия КФС № 1 на возбудитель кандидоза – C. aldicans и функциональную активность клеток врожденного иммунитета, за¬раженных указанными дрожжеподобными грибами.
Материалы и методы
  Для получения контрольной культуры лабораторных штаммов C. aldicans был использован питательный агар на основе панкреатического гидролизата кильки производства НПО «Питательные среды», г. Махачкала (рН 7,3±0,2, содержание аминного азота 104 мг/%), C. aldicans выращивали в течение суток при 18-20 °С. Оценивалась биологическая активность дрожжей и подсчитывалось количество колониеобразующих единиц, а также исследовалась жизнеспособность C. aldicans после воздействия на них КФС в течение 30, 45 мин и 1, 2, 3, 4 и 5 ч. Морфология оценивалась с помощью электронной микроскопии для чего суспензию дрожжей центрифугировали в течение 20 минут при 1 800 об/мин в течение 1 часа фиксатором Ито. Далее бактериальные суспензии при температуре 4°С обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации. Для заливки образцов использовали эпоксидные смолы (Serva, USA). Из образцов, залитых в эпоксидные смолы, изготавливали серийные ультратонкие срезы на ультрамикротоме LKB-V (Швеция). Срезы толщиной около 80 нм помещались на подготовленные к работе медные сетки 3 мм и высушивались. Ультратонкие срезы на сетках контрастировали в насыщенном растворе уранилацетата (Serva, USA) и ще¬лочном 0,02% растворе цитрата свинца (Serva, USA). Препараты исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100 S (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Микрофотосъемку производили на фотопластинки для промышленных и научных целей ПФП-01Т размером 6x9 см.
  Для изучения иммунной защиты организма под воздействием КФС в качестве модели использовали первичную культуру нейтрофилов и моноцитов/макрофагов. Фракцию адгезирующих клеток получали из гепаринизированной (10 ед./мл) венозной периферической крови. В камере Горяева подсчитывали количество клеток с верификацией нейтрофилов и мононуклеаров по форме клеточного ядра. Число моноцитов составляло от 1 до 5% и нейтрофилов от 47 до 72% от общего количества ядросодержащих клеток. Концентрацию клеток доводили до 441 О6 кл/мл. Лейкоцитарную суспензию вносили в лунки плоскодонного планшета для иммунологических реакций по 1 00 мкл в лунку, в триплетах для каждого образца. Время воздействия КФС составило 30 мин, после чего вносили суспензию C. aldicans из расчета 1 фагоцит на 10 дрожжевых клеток. В качестве контроля служили клетки без воздействия КФС. Исследовалось цитотоксическое действие дрожжей по индексу гибнущих клеток (некроз, апоптоз), активность ферментов бактерицидной системы: 5'-нуклеотидазы, АТФ-азы, лактатдегирогеназы (ЛДГ), цитохромоксидазы (ЦХО), миелопероксидазы (МПО) и неферментных катионных белков [4]. Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов выражали в виде унифицированного показателя - индекса стимуляции (Т) в процентах, который вычисляли по формуле: Т = (No-Nk)/Nk х 1 00; где Nk - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в нестимулированных клетках; No - средний показатель оптической плотности исследуемого субстрата в стимулированных клетках.

  Результаты и обсуждение

  Морфологические исследования показали, что C. aldicans имели округлую и эллипсоидную форму и размеры, соответствующие расе (рис. 1 а). Клетки были равномерной величины, с тонкой оболочкой, однородной или мелкозернистой цитоплазмой с небольшими вакуолями.Бактерицидная эффективность КФС
  Известно, что акридиновый оранжевый — это флуорохроматический краситель, который связывается с нуклеиновыми кислотами бактерий и других клеток. В среде буфера при рН 6.0 акридиновый оранжевьй мономер красителя связывается с двухспиральными (максимум флуоресценции 530 нм), а димер с односпиральными нуклеиновыми кислотами (максимум флуоресценции 640 нм). В результате такого взаимодействия красителя с биомолекулами по флуоресценции можно различать состояние ДНК микроорганизмов. В норме в дрожжевых клетках двуспиральная кольцевая ДНК конденсирована в компактное образование - хромосому, которые включены в нуклеоид, где концентрация достигает ДНК 50-1 00 мг/мл. При изменении рН, в случае нарушения проницаемости мембран, например при некрозе, связь ДНК с белками нарушается, в результате чего двухнитевая молекула ДНК преобразуется в однонитевую и пик флуоресценции смещается в сторону красного спектра 640-720 нм. Нами при изучении жизнеспособности C. aldicans с помощью конфокальной микроскопии установлено, что 96±7.6 % клеток имели зеленое интенсивное свечение, характеризующее стабильное состояние ДНК (рис. 16). После 45 мин воздействия КФС установлено появление дрожжевых клеток в состоянии некроза. С увеличением времени воздействия прибора количество жизнеспособных C. aldicans снижалось и минимальное число составило 35±2.4% после 5 ч (рис. 2).Морфология клеток дрожжей C. albicans  после воздействия КФС
  Также при высеве на питательную среду дрожжей после воздействия на них КФС определялось уменьшение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) и изменялась морфология колоний (рис. За,б).Культура C. albicans до воздействия КФС и после 5 часового воздействия КФС
  С целью уточнения морфологических различий нами было проведено электронномикроскопическое исследование контрольных и опытных культур C. aldicans. Как показано на рис. 4а в экспоненциальной фазе роста у C. aldicans контрольной культуры присутствовали все органеллы, характерные для дрожжевых клеток. Наличие тонкой, менее 0,5 мкм, плотной и эластичной клеточной оболочки, состоящей из клеточной стенки и плазматической мембраны, указывало на присутствие в культуре преимущественно молодых клеток. Известно, что по мере старения оболочка имеет тенденцию к утолщению до 1 мкм. Цитоплазма клеток была однородной, с мелкими вакуолями, четко визуализировалось ядро и ядерная мембрана с плотной нуклеоплазмой. Рибосомы равномерно распределены в пространстве, обнаруживались митохондрии и аппарат Гольджи.Бактерицидная эффективность КФС  После воздействия КФС дрожжевые клетки приобретали неправильную форму, их стенка становилась извилистой, у части из них отмечалось образование немногочисленных простеков. Считается, что как и повышение извилистости клеточной стенки, так и образование простеков способствует усилению поступления питательных веществ в клетки.
  Также в клетках C. aldicans обнаруживался локальный лизис цитоплазмы и многочисленные огромные вакуоли (рис. 46), а также наблюдалось увеличение цистерн эндоплазматической сети. Таким образом, установлено непосредственное бактерицидное воздействие КФС на C. aldicans с максимальным эффектом после 5 ч.
Захват клеток Candida spp. фагоцитами иногда сталкивается с трудностями, отчасти обусловленными размерами грибковой клетки - крупной псевдогифы или истинной гифы C. aldicans. В некоторых случаях фагосома не образуется, а псевдоподии фагоцитов перекрещиваются друг с другом. Изредка в захвате грибковой клетки участвуют даже псевдоподии разных фагоцитов [9]. Постепенное поглощение клетки гриба происходит при участии компонентов цитоскелета, в частности, микротрубочек и микрофиламентов из С- актина [1 0]. Средства уничтожения фагоцитированных Candida spp. представлены системами кислородных радикалов, оксида азота и неокислительными механизмами.
  Нами обнаружено, что в течение всего наблюдаемого периода воздействия КФС (5 ч) на клетки отмечалось улучшение морфологического состояния нейтрофилов и макрофагов. Поскольку нас интересовало физиологическое воздействие КФС на клетки врожденного иммунитета, в эксперименте мы стимулировали фагоциты до внесения дрожжевых клеток.
  При подсчете фагоцитарных показателей обнаружено, что после воздействия КФС клетки более активно поглощали C. aldicans (рис. 5). Так, если без воздействия КФС фагоцитарный показатель - процент клеток, поглотивших дрожжи (ФП) через 30 мин составил 46±5,2 % и 2 ч 52±4,8 %, то после воздействия КФС он повышался в 1,3 раза и был равен 55.2±4,7 и 61,7±5,7 % соответственно. Фагоцитарное число - количество поглощенных C. aldicans без воздействия прибора через 30 мин составило 2,4±1,6 и через 2 ч 3,2±1,7, что указывало на размножение C. aldicans в клетках. После воздействия КФС этот показатель составил 3,2 ±1,7 и 2,8±1,5 соответственно. Данный факт подтверждает стимулирующее воздействие прибора на бактерицидную активность фагоцитов. Фагоцитоз C. albicans при воздействии КФС  Одним из характерных признаков стимуляции фагоцитирующих клеток является снижение внутриклеточного содержания АТФ-азы и 5'-нуклеотидазы плазматической мембраны клеток, поэтому с целью дифференцировки активированных и покоящихся клеток исследователями используется тест по определению активности этих ферментов [3]. Снижение уровня их активности, играющих важную роль в регуляции аденозинового обмена, рассматривается как проявление биохимических процессов, сопровождающих активацию фагоцитов. Таким образом, определение активности эктоферментов мембраны клеток врожденного иммунитета, к которым относят АТФ-азу, 5'-нуклеотидазу позволяет оценить степень их стимуляции.
Определено, что под влиянием КФС достоверно усиливалась активация нейтрофилов и макрофагов, зараженных дрожжеподобными грибами (Рис. 6а,б).Показатели активности ферментов плазматической мембраны фагоцитов после воздействия КФС  Известно, что при различных патологических состояниях организма значительно увеличивается количество кислорода, потребляемого фагоцитирующими клетками. На первом этапе преобразования молекулы кислорода в супероксидный анион 02’", донором электронов является НАДФ-оксидазный комплекс. Супероксидный радикал - 02*' является начальным материалом для продукции обширного ряда реактивных оксидантов, включая окисленные галогены, свободные радикалы и синглетный кислород. Лактатдегидрогеназа, которая входит в ферментные системы кислородозависимого механизма фагоцитов, катализирует передачу восстановленного эквивалента от лактата на НАД+ или от НАДН на пируват. Другой фермент цитохромоксидаза входит в состав 3-го ферментного комплекса, который принимает участие в последнем этапе преобразования молекулярного кислорода в супероксидный анионный радикал. Под воздействием КФС возрастала активность компонентов кислородозависимой бактерицидной системы фагоцитов, зараженных C. aldicans. Так, активность ЛДГ, которая принимает участие в начальном преобразовании субстрата, используемого в образовании реактивных видов кислорода, увеличивалась в 4 раза, стимуляция ЦХО, участвующего в переносе электронов на молекулярный кислород и отражающего уровень окислительного метаболизма в клетках, в 2 раза (Рис. 6в,г).
  Важная роль окислительного звена защиты нейтрофилов и макрофагов доказывается усилением фунгицидной активности этих клеток под действием рекомбинантной миелопероксидазы [9]. Дефицит миелопероксидазы приводит к незавершенности фагоцитоза и считается одним из наиболее важных среди факторов, предрасполагающих ко всем формам кандидоза [1 0]. Преобразование супероксидного аниона в следующий мощный окислительный компонент - перекись водорода (Н2О2) может происходить спонтанно или катализироваться супероксиддисмутазой. Миелопероксидаза, железосодержащий протеин, выступает в качестве катализатора следующего пути преобразования перекиси водорода в гидроксильный радикал (’ОН) из гипохлорной кислоты (НОС1) и супероксидного аниона. В настоящее время путь образования 'ОН с этим ферментом носит название - миелопероксидазно-перекись водорода-хлоридная система. В большей степени миелопероксидаза определяется в азурофильных гранулах нейтрофилов.
  Под воздействием КФС определялось существенное повышение активности МПО в зараженных C. aldicans клетках, субстратом для которой является перекись водорода, образующаяся наряду с кислородным радикалом в стимулированных фагоцитах (Рис. 6д). Этот фермент отражает защитную реакцию клеток в ответ на внедрение инфекционного агента. Помимо этого, под воздействием КФС увеличивалось внутриклеточное содержание неферментных катионных белков, которые принимают участие в обезвреживании бактерий.
Заключение.
  Несмотря на агрессивное влияние сложной многоуровневой системы защиты макроорганизма, грибам Candida spp. нередко удается противостоять этому влиянию и успешно вызывать инфекцию. Здесь больше всех преуспевает вид C. aldicans, во многом благодаря своей изменчивости и широким адаптационным способностям. Смена фаз роста, существование при разных температуре и кислотности, переключение фенотипов позволяют C. aldicans и некоторым другим видам Candida приспосабливаться к воздействию естественных защитных факторов.
  Полученные нами экспериментальные данные установили бактерицидный эффект КФС № 1 на C. albicans. Помимо указанного воздействия на сам возбудитель, прибор усиливает компоненты неспецифической защиты организма, а именно - стимулируя бактерицидную активность клеточных элементов врожденного иммунитета - нейтрофилов и макрофагов. Как известно, эти клетки составляют первую защитную линию организма при инфекционных болезнях. Учитывая тот факт, что среди множества состояний, предрасполагающих к кандидозу, прежде всего это расстройства клеточного иммунитета, в том числе наблюдаемые при ВИЧ-инфекции и СПИДе, а поражения внутренних органов при этих патологиях невозможно без тяжелого расстройства фагоцитоза, постоянное применение КФС №1 может дать положительный эффект, усиливая защитные функции организма против C.albicans.

^ Наверх